Module BIOCHIMIE/ANALYSE GANETIQUE Elément ANALYSE GENETIQUE S4

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Université Molay Ismail

Faculté des sciences

Meknès

Département de biologie

Module BIOCHIMIE/ANALYSE GANETIQUE

Elément ANALYSE GENETIQUE
S4

                                                                                                                                                                                                                      

Compte rendue des TP de génétique

REALISE PAR :

Sfendla anis

Sahli abdelwahabe

Slaoui andaloussi oussama

                                                                                                 Année universitaire : 2009/2010

Sommaire   

 

 

 

Introduction

 

 

 

Séance 1 :   extraction d ADN plasmique.

 

 

 

Séance 2 :   électrophorèse des acides nucléiques sur

                   Gel horizontale d’agarose.

 

 

 

Scence3 : transformation bactérienne.

 

 

 

Conclusion

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Séance 1 : extraction d ADN bactérien

 

But

   Extraction  d’ADN plasmique à partir d’une bactérie

Mode opératoire

  Pour l’extraction d’un ADN, il faut procéder par plusieurs étapes à partir des cultures bactériennes à  l’ADN.

  Les bactéries utilise sont des DH5ALPHA ces bactéries entrent dans divers expériences car ils ont une mutation de relA et des mutations dans les gènes de endA (endonuclease) et de relA (système de recombinaison) ces mutation augmentent l’intégrité structural du plasmide (DH1, DH5, DH5 et ALPHA et DH10B…) lors de l extraction on met on jeu un facteur de pois car ADN P<<ADN G.

Définition.

 

Tube eppandorfe: ou même micro tubes sont de petits tubes munis d’un capuchon à visser ou à clipser. Ils sont en matière plastique, le polypropylène, capable de résister aux hautes températures (autoclavage, utilisation dans des thermocycleurs…), aux basses températures (stockage dans un congélateur à -80°C, broyage à l’azote liquide…) ou aux solvants organiques.

Ils existent en différentes contenances :

  • 2 ml
  • 1,5 ml
  • 0,5 ml
  • 0,2 ml (200 µl) : tubes à PCR

Ils existent aussi en diverses couleurs : bleu, rose, vert…Sur le capuchon et sur le côté du tube, il y a des emplacements pour inscrire les références des échantillons au marqueur (analyse médicale..).

Il existe de petits portoirs en plastiques spécialement conçus pour tenir les micros tubes, qui n’ont généralement pas de bases plates. On achète les tubes en grandes quantités qu’on aliquote de façon stérile (en mettant des gants) dans d’anciens bocaux à confiture, que l’on autoclave ensuite. Les plus petits tubes (200 µl) peuvent être achetés en « barrettes » de 8 ou de 12, réunis de bord à bord par un petit pont de plastique.

Figure 1: Micro tube 1,5 ml classique

Si l’on est droitier, on tient généralement le tube dans les premiers doigts de la main gauche. On se sert du pouce pour ouvrir ou fermer le capuchon, ou de la main droite si c’est un capuchon à vis. On peut ainsi se servir de la main droite pour effectuer les pipetages avec la pipette automatique.

Les micros tubes sont à usage unique. S’ils n’ont pas besoin d’être conservés pour stocker un échantillon, ils sont jetés. Il est trop difficile de les nettoyer pour pouvoir s’en resservir, sans risquer les transcontaminations.

 

Figure 2 : tube eppandorfe

 

Centrifugation : séparation des contenue d’une solution grâce a leur pois moléculaire grâce a un centrifugeur. Une centrifugeuse est un appareil destiné à imprimer une accélération, grâce à un mouvement de rotation, à un mélange liquide-solide (par exemple, un colloïde). Le plus souvent, le mélange est déposé dans un récipient perforé de multiples orifices, la taille de ceux-ci étant suffisamment grande pour laisser passer le liquide et assez petite pour empêcher le passage du solide. Ce type d’appareil peut aussi servir à séparer les mélanges constitués de parties ayant une densité différente.

Cet appareil se trouve dans des applications technologiques et industrielles très importantes :

Figure 3 : une centrifugeuse

PLASMIDE : c’est une molécule d’ADN circulaire bicentenaire extra chromosomale dont la taille variée de 2kb a 20kb, il peut conférer  des propriétés nouvel a la cellule hôte.

Micropipette :

Les micropipettes sont obtenues à partir d’un capillaire de verre (environ 0,5 cm de diamètre) dont le centre est chauffé par une étireuse en même temps que les deux extrémités sont tirées. Le verre s’effile jusqu’à rupture et on obtient deux micropipettes dont l’extrémité environ conique a le diamètre souhaité. On peut obtenir le diamètre que l’on souhaite en variant le programme de chauffe-étirement de la tireuse.

Figure 5 : micropipette

 

 

 

 

Vortex ou mélangeur de réactif :

Le Vortex est une machine servant à mélanger des produits dans un tube à essai ou micro tube pour être sûr que les molécules se mélangent. L’outil est circulaire, dans le creux au milieu d’un cercle en plastique on pose le tube à essai contenant les réactifs. Le tube à essai vibre de telle sorte qu’un mélange parfait se crée. Il en existe de plus ou moins puissants pour de plus ou moins grandes quantités.

Figure 6 : vortex

Étapes de l’extraction bactérienne (mode opératoire)

 

Etape1et2 :

On prend 1.5ml de la culture bactérienne et on la verse dans un tube eppandorfe et on pratique une centrifugation pendant 2minute on un surnageant quand va se débarrasse et un culot que l’on ajoute la même quantité que on a ajoute on premier c’est-à-dire 1.5ml et comme précédemment une centrifugation de 2minute on conserve le culot qui correspond a des bactéries et le surnageant au milieu de culture.

 

Etape 3 :

 

On ajoute 5microlitre grâce à une micropipette.

Une solution de TEG (tris HCL ; EDTA et G glucose. tris HCL c’est une solution qui maintien un milieu tampon et régule le PH le EDTA c’est un chélateur des ions Ca2+ et Mg2+ qui fragilise la paroi bactérienne et bloque le fonctionnement des nucléase il protège l’ADN enfin il y a présence du  G glucose qui est une source d’énergie et de viscosité a fin de protéger les protéines.

 Puis on ajoute des lysozymes c’est une enzyme qui provoque des cassures et des perforations au niveau de la paroi bactérienne, Pendant  10 minute. Puis une autre fois 50microlitre de TEG.

Etape 4 :

L’ajout de 200microlitre d’une solution de NAOH a 0.2N et du SDS (joue sur la pression interne) et on les conserve a 0°C  pendant 10 minutes.

Le NAOH est un produit qui est très corrosif  il fragilise les parois bactérienne, pour le SDS il provoque une pression intra bactérienne a fin de libérer le contenue cytoplasmique et il se précipite facilement dans la glace.

 

Etape 5 :

 

A cette solution on ajoute 150 microlitre de NA AC a 3M c’est l’acétate de sodium il provoque l’agglutination des protéines qui dans leurs enchevêtrement entraine l’ADN Génomique car il a une grande taille.     

On observe des protéines qui se gélifient sous forme de filament dans les tubes eppandorfe. On les met au froid à 20°C et on pratique une centrifugation de 10 minutes.

 

Etape 6 :

 

[SEL] >= 0.3M

Ethanol : on met un volume 2 fois plus que le volume de du surnageant puis 10 minutes dans le froid puis une autre fois 1ml d’éthanol puis une centrifugation de 10minute.   

Calcule de concentration en sel :

  Le sel ne provient que de NA AC en a :

 

Ci= 3M

 

Vi= 50 microlitre

 

Vf=50+50+15+200+150= 465microlitre

 

Ci*Vi = Cf*Vf

 

Cf= 0.96 M

 

 

 

Séance 2 : électrophorèse des acides nucléique sur gel horizontal d’agarose

 

But :

Observation d’ADN et d’ARN sur un gel horizontal d’agarose.

Mode opératoire :

Cette manipulation nécessite un  gel dans le quelle les ADN vont se déplacer, on prépare ce gel a partir d’une poudre d’agarose a 0.6% et que l’on ajoute 40ml e TDE*1 dissoute dans l’eau. A note que plus on diminue la concentration d’agarose la résistance est faible.

Pour avoir un (bon) gel il faux qu’il soit supérieur ou égale a 0.4%  et inférieure ou égale a 20.5%

0.6 g _______  100ml

X    ________ 4 ml

X= 0.6*4/100

X= 0.28g

 

X c’est la quantité de poudre qui est utilise dans 4 ml.

Une fois préparé on va pratiquer une ébullition et on le refroidit et l’on ajoute un produit rouge appelé « BET » (toxique).

Figure 7 : électrophorèse

Le bromure d’ethidium (BET) solution rouge c’est un agent intercalent il s’intercale entre les base  des acides nucléiques  ce qui provoque l’expression des oncogènes (les gènes qui sont responsables des tumeurs) et ils fluoresce sous rayonnement ultraviolet.

Figure 8 : Lampe à U.V

NB : tous les agents intercalent sont consiregéne par excellence.

Le tampon de migration « TBE*1 »assure les charge nécessaire pour véhiculer le courant électrique, il garde la même concentration dans les différents compartiments d’électrophorèse, afin d’assurer l’homogénéité de la migration.

On ajoute au tube eppandorfe des ADN qui était conservé dans le frigo, on leur ajoute une solution c’est le bleu de charge qui va permettre  d’alourdir l’ADN.

On verse le gel dans la chambre d’électrophorèse, que l’on maintien grâce a un scotche pour que le gel ne se verse pas jusqu’à qu’il se gélifie. A ce gel on ajoute du TEB*1 afin de permettre le passage du courant.

La solution de dépôts ou de charge il se compose de :

  • 50%de glycérol.
  • 50% TBE*10.
  • 1 mg/ml bleu de bromo phénol 5mg/5ml.

Pour préparer 5ml de cette solution on a besoin de :                                                                                                                                                 

  • 5ml/2 du glycérol = 2.5ml.
  • 5ml/2 du TBE*10 = 2.5ml.
  • Et 5mg/5ml de bleu de bromo phénol.

Methode1 :

Du TBE*1 c’est la solution mère, pour le TDE*10 on doit faire une dilution :

Ci. Vi = Cf. Vf

10*vi=1*40

Vi=4ml=QSP

Et on complète avec 36ml d’eau.

 

Methode2:

On a [F] = _ [I] _

                 D

 

VF= VI + (d-1) v (H²O)

 

VF = VI + d. V – 1V

V=VF / d

V= 40/d = 4ml

d=10.

 

Pour savoir la concentration TBE :

Vf = 4v + 1v = 5v

Vi= 4ml     Ci = 50%    Vf = 20 ml

Ci*vi = Cf.*Vf

Cf = 1.

Séance 3 : transformation bactérienne

 

  But :

Cette manipulation consiste à transformer le phénotype des bactéries sensibles à l’ampicilline en des bactéries résistantes.

  • Préparation du matériel et des milieux 

Le matériel nécessaire doit être stérilisé et les milieux stériles préparés préalablement aux manipulations proprement dites.

    • Préparation des milieux

Deux milieux différents doivent être préparés : un milieu liquide ou bouillon (LB : Luria broth) permettant la multiplication des bactéries receveuses et un milieu solide (LA : Luria broth agar), similaire au précédent mais contenant de l’agar pour le rendre solide. Une partie de ce dernier est utilisée pour réaliser un milieu contenant de l’ampicilline destinée à sélectionner les bactéries transformées.
Les deux milieux sont reconstitués à partir des boîtes de poudre fournies en dissolvant respectivement 25 g de poudre LB dans un litre d’eau distillée et 32 g de poudre LA dans un litre d’eau distillée. Ils sont ensuite stérilisés. 
L’addition de l’ampicilline au milieu LA à raison de 100 µg.mL-1 doit être faite après la stérilisation, au moment de couler le milieu dans les boîtes de Pétri car l’ampicilline est thermolabile. 
La solution de chlorure de calcium fournie doit être diluée au 1/10 avec de l’eau distillée avant stérilisation et répartie dans des tubes Eppendorf à raison de 0,5 ml par tube (50 mmol.L-1).  

    • Stérilisation du matériel

Il est possible de se procurer les petits matériels (pipettes Pasteur, boîtes de Pétri, cônes de pipette, tubes Eppendorf) déjà stérilisés et conservés dans un emballage stérile. Dans ce cas, n’ouvrir les emballages que dans la zone stérile à proximité du bec Bunsen.
Les milieux LB et LA ainsi que le petit matériel  (pipettes Pasteur, boîtes de Pétri, cônes de pipette, tubes Eppendorf, solution de chlorure de calcium, eau distillée) peuvent être stérilisés à l’autoclave ou, à défaut, à la cocotte minute. Dans ce cas, mettre un peu d’eau au fond de la cocotte (sur 2 cm de hauteur) et placer dans le panier destiné à la cuisson à la vapeur le petit matériel enveloppé dans du papier d’aluminium et les flacons. Attendre 20 minutes après la mise en rotation de la soupape.
Les flacons et les paquets de papier d’aluminium contenant le petit matériel sont ensuite disposés à proximité du bec Bunsen et doivent être ouverts dans la zone stérile autour de la flamme.
 

Mode opératoire :

 

  On prend des bactéries sensibles à l’ampicilline (agit sur des enzymes qui rentrent dans la fabrication de la paroi bactérienne.) dont la croissance est en phase exponentielle.

Dans un tube Eppendorf  qui contient des bactéries+ sob (Milieu de culture favorisant la croissance des bactéries a 37°C, Mg²+) après centrifugation (On obtient le culot+surnageant).

On élimine le surnageant. Le culot obtenu à qui on a ajoute TFb1 :

  • Glycérol (Empêche l’éclatement des bactéries lors du changement brusque de température ;
  • Lb ;
  • Ca Cl2 (rendre la paroi perméable au Ca Cl2).

On refait l’opération une 2ème fois pour que les bactéries deviennent compétentes : les bactéries sont aptes de recevoir l’ADN exogène leur paroi est perméable.

    • On prépare trois milieux :

    Le premier : 100ml des bactéries compétentes +2µl d’ADN p (puc 19) à 0°C (choc thermique) + 1ml de L.B pendant 45 min a 37°C (temps de latence phenotique) + ampicilline.

    Le Deuxième : 100 ul de bactéries + 2 ml H2 O + Ampicilline.

    Le troisième : 100 ul de bactéries + 2ml d’ADN p – Ampicilline.

figure 11 : Quelques colonies de bactéries résistantes
(donc transformées : milieu avec ampicilline)


figure 12: Tapis de bactéries transformées ou non
(milieu sans ampicilline)

Culture des bactéries receveuses

Les bactéries receveuses sont fournies sous forme de colonies sur boîtes de milieu solide :

 

 

Figure 9 : Colonies de colibacille sur boîte de Pétri

 

Elles doivent être mises en culture dans le bouillon LB avant d’entreprendre leur transformation.
Pour cela, prélever stérilement quelques colonies avec un ensemenceur ou un cure-dents stérile et les placer dans un tube stérile de bouillon LB. 
Agiter le tube sur vortex et incuber 24 h à 37°C (48 h à température ambiante). La multiplication des bactéries se traduit par l’apparition d’un trouble dans le milieu comme on peut le voir sur le cliché ci-dessous.   

  • Protocole de transformation international :
     
  • Pour réaliser la transformation proprement dite, réunir :

1.    2 tubes contenant 1 ml de culture bactérienne. Marquer les tubes par « pUC+ » et « pUC- » respectivement.

2.  1 tube contenant de l’eau distillée stérile

3.  1 tube contenant 0,5 ml de la solution de chlorure de calcium

4.  1 tube contenant 15 µL de la solution de plasmide pUC 19 (2,5 ng.µL-1)

5.  2 boîtes de Pétri avec milieu solide LA sans ampicilline

6.  2 boîtes de Pétri avec milieu solide LA additionné d’ampicilline (100 µg.mL-1)

7.  Bac de glace pilée

8.  Bain marie à 42°C

9.  1 râteau réalisé en pliant à la flamme l’extrémité d’une pipette Pasteur boutonnée comme on peut le voir sur le cliché ci-dessous. Bien que la notice du kit préconise d’utiliser des billes de verre (fournies) pour étaler les bactéries, le rateau s’avère plus efficace pour cet usage.
 

 

 

Procédure
 

 

 

 

 

Objectif des opérations réalisées

1. Centrifuger les deux tubes pUC+ et pUC- à 3 500 tours/minute pendant 3 minutes et éliminer le surnageant.Récupération des bactéries en suspension.2. Ajouter 200 µL de solution de chlorure de calcium et 10 µL de la solution de plasmide au tube pUC+.
3. Ajouter 200 µL de solution de chlorure de calcium et 10 µL d’eau stérile au tube pUC-.

Le calcium fragilise les enveloppes bactériennes facilitant ainsi la  pénétration du plasmide.

Témoin négatif.

4. Remettre en suspension les deux culots en agitant sur vortex et placer les deux tubes dans la glace pendant 10 minutes.
5. Placer les deux tubes au bain marie à 42°C pendant 90 secondes.
6. Remettre les deux tubes dans la glace pendant 10 minutes. Choc thermique.7. Ajouter 400 µL de bouillon LB dans chacun des tubes.Milieu nutritif pour faire pousser les bactéries.8. Déposer 100 µL (ou 3 gouttes) du tube pUC+ au centre d’une boîte avec ampicilline et 100 µL au centre d’une boîte sans ampicilline.Permet de mesurer l’efficacité de la transformation en comparant le nombre de colonies dans les deux boîtes.9. Déposer 100 µL du tube pUC- au centre d’une boîte avec ampicilline et 100 µL au centre d’une boîte sans ampicilline.Témoins non transformés.10. Utiliser le râteau (passé à la flamme puis refroidi) pour étaler les bactéries à la surface du milieu dans chaque boîte. Veiller à bien stériliser le râteau entre deux étalements.Répartition des bactéries sur toute la surface du milieu.11. Incuber les boîtes à 37°C pendant 24 à 48 h en les plaçant couvercle vers le bas.Croissance des bactéries. Le retournement des boîtes empêche l’eau de condensation de se déposer sur les cultures.
 

  • Résultats

Dans les boîtes contenant de l’ampicilline, seules les bactéries ayant intégré le plasmide portant le gène de résistance à l’ampicilline sont capables de pousser. Comme un petit nombre seulement de cellules sont transformées, on observe un petit nombre de colonies seulement. 
Dans les boîtes ne contenant pas d’ampicilline, toutes les bactéries poussent. Comme elles sont très nombreuses, les colonies deviennent confluentes et forment un tapis continu (« gazon ») à la surface du milieu. 

 

 

Interprétations et conclusions:   

 

   Apres 24 heures a 37°C :

Dans le 1er milieu : La présence de plusieurs colonie de bactéries ;

   Dans le 2° milieu : La présence infime de colonie bactérienne ;

   Dans le 3° milieu : La présence de quelque colonie bactérienne.

 

 

D’après ces conclusions, la présence d’ADN p (puc19) provoque une transformation bactérienne et on obtient comme produit des bactéries résistantes à l’ampicilline.

 

 

Conclusion

 

 

 

 

 

 

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